目的

生物學的研究過程通常需經三個階段：首先由基礎的細胞層次開始，接著進入動物模式，最后再進行ren試驗研究；

所以細胞培養技術是現代生物技術研究最基本的實驗技術之一。本實驗是使用F12 培養液來培養人類橫紋肌肉瘤RD 細胞株，

借著實驗的操作過程可使操作者熟悉無菌操作與細胞繼代培養的相關技術。

 

 

原理

本章節所介紹之細胞培養相關技術有三：

細胞繼代培養技術：由于細胞貼附在培養皿上需要鈣離子的參與，所以可利用具有螯合鈣離子特性的EDTA ，配合胰蛋白酶(trypsin) 的作用，將細胞自培養皿上分離出來。

細胞數及細胞存活率計數技術：死細胞由于細胞膜破損，所以細胞染劑如：錐藍(trypan blue) 可自由進出細胞膜，因而將死細胞的細胞核染上顏色，但活細胞則否，所以可配合血球細胞計數盤(hemocytometer) ，于相位差顯微鏡下計算出活細胞數量并估算出細胞存活率。

 

細胞保存及解凍技術：利用抗凍劑DMSO 可以減少細胞于冷凍過程中受到冰晶的傷害，因此在細胞溶液中加入適當比例的DMSO ，則可于液態氮中長期保存細胞株

 

 

材料與器具

實驗儀器及用具

實驗材料

 

實驗儀器及用具

低溫保存管(cryotube) （細胞用）及低溫保存盒

細胞培養皿(petri dish)

微量吸管及電動吸管(pipette and pipette aid)

血球細胞計數盤(hemocytometer)

相位差顯微鏡

37℃ 二氧化碳細胞培養箱(CO2 incubator)

恒溫水浴槽(water bath)

無菌操作臺(laminal flow)

桌上型離心機

液態氮桶

 

實驗材料

F12 培養液

二次蒸餾水(ddH2O)

胎牛血清(fetal calf serum ；FBS)

重碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)

TE(trypsin-EDTA) 溶液

磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffer-saline ；PBS)

抗生素（penicillin 100,000 IU/L 及streptomycin 100 mg/L ）

細胞染劑(trypan blue solution 0.4%, w/v)

 

抗凍劑(dimethyl sulfoxide ；DMSO)

75% 酒精